最近听闻前公司和另一家公司A因为一个项目中二代测序数据PCR duplication的问题在扯皮。前公司比较两对Paired-end reads的第8~113bp区间内碱基是否完全相同（PE150）；而A公司把1~150bp都完全相同的才当作PCR duplication。最终参数的分歧使得两家公司的统计结果相差接近一倍，关乎到数据量是否的满足合同要求。

而前公司这部分QC流程的参数就是我设置的。选择截取reads中间的区域进行比较的原因很简单，因为Illumina测序前面几个碱基和末端的区域通常测序质量较差，测序错误较多。如果要求两对reads完全一致，相当于600bp（150*2*2）不能出现任何测序错误。具体为什么设置成8~113bp我并没有详细去分析和论证，只是因为当时测序都外包给N公司做，而N公司内部QC流程去PCR duplication设置的范围设置的就是这个，我也就顺理成章用了同样的参数。

那么怎样去除二代测序数据中的PCR duplication才是科学的姿势呢？虽然对很多人来说应该是一个无聊的论题，但是我还挺好奇，本文姑且在这里分析一二。

PCR duplication产生的原因和特点

PCR duplication是由二代测序建库过程中的PCR产生的，其特点是插入片段完全相同。因此如果不考虑测序错误，那么测到的序列也应当完全相同。PCR duplication的产生不仅没有提供新的信息，还会影响许多下游的分析。比如通过kmer分析估算基因组的重复率，PCR duplication也会被统计到基因组的重复率中。其他下游分析比如变异检测、利用mate-pair reads进行基因组的scaffolding、Hi-C的数据分析等都会受到影响。

去除二代测序中的PCR duplication的方法

目前有很多现成的软件可以去PCR duplication，我在这里整理了几种常见的软件或方法：

1. 要求全长序列完全相同，以FASTX-Toolkit为代表

FASTX-Toolkit是一个2009年就发布的处理FASTA/FASTQ格式文件的工具包。FASTX-Toolkit中的组件fastx_collapser可用于处理PCR duplication。其原理是将FASTA/FASTQ中的序列进行比较，完全相同的序列只保留一个，和A公司的方式一致。

2. 要求5'端对齐的子序列完全相同，以FastUniq为代表

FastUniq于2012年发表在PLoS ONE上，是一个专门用来快速去除PCR duplication的的软件。相比FASTX-Toolkit仅支持SE reads，这款软件支持PE，并且在运行速度上有较大提高，声称可以在10分钟内处理8700万条reads。

FastUniq支持不同长度的reads序列比较，但是因为是通过归并排序算法（merge sort algorithm）排序后从5'开始逐个位点比较相邻序列的碱基，因此需要两条不同长度的reads在5'端是对齐的。因为需要序列完全相同或者短序列完全被长序列包含，因此和A公司的处理方式也一致。FastUniq的文章中也指出，这种方式由于只基于序列比较，对于杂合或者测序错误引起的SNP是敏感的。

3. 要求截取的部分序列相同，NextClip为代表

NextClip是一款专门针对Nextera MP文库数据的处理工具，于2013年发表在Bioinformatics上。它在处理PCR duplication上使用了kmer-based方法——将一对MP reads的前11个碱基和中间的11碱基共同构成44-mer序列进行比较。

另外有两款比较常用的二代测序数据质控软件会截取部分序列对PCR duplication进行估算——fastp使用了read1的前12bp序列和read2的前32bp序列；FastQC中所有超过75bp的序列会截短成50bp进行比较。两款软件都只是对重复序列进行估算而没有去重复的功能。

另外FastQC的文档中认为用过长的序列会因为测序错误导致低估duplication rate：

Even so, longer reads are more likely to contain sequencing errors which will artificially increase the observed diversity and will tend to underrepresent highly duplicated sequences.

4. Mapping-based method（基于参考基因组比对的方法）

与上面通过reads间比较的de novo法不同，如果有参考基因组，可以通过BWA、Bowtie等比对工具将reads比对到基因组。相同比对位点和方向的reads被认为是可能的duplicates，可以使用Samtools的rmdup或者picard的MarkDuplicates等工具去除或标记重复。

5. 几种方法的总结

这里不讨论基于比对的方法或者unique molecular identifier（UMI）。上面de novo的方法有的用到全长比较，而有的考虑到性能因素只截取少部分序列进行比较（NextClip和fastp最少，一对reads只用到44bp）。序列太短可能会产生假阳性，而序列太长则会对测序错误更敏感。FastQC的文档中就提到，用过长的序列会因为测序错误导致低估duplication rate：

Even so, longer reads are more likely to contain sequencing errors which will artificially increase the observed diversity and will tend to underrepresent highly duplicated sequences.

前面提到两家公司的争论也就在此。一方认为1~150bp过于严格，产生很多假阴性；另一方认为8~113bp过于宽松，会导致假阳性。虽然两条完全随机的序列比较，出现44bp正好相同的概率非常低，只有1/4⁴⁴，但是基因组中并不是完全随机的序列，重复序列会使得问题更复杂。

另外这几个截取部分序列的软件都倾向选择5'端（起始位点为1）。picard MarkDuplicates也是如此，比较的是5'端的坐标。可能是因为越接近3'端，因为InDels导致错位的概率就越高。而reads不同位点测序错误率分布的影响则不是主要关心的问题。

上面这些都只是逻辑上的推理。如何选择合适的序列长度和起始位点，可以使用基于参考基因组比对的结果作为PCR duplication的标准进行评估。

分析方法和结果

1. 测试数据的选取

选取NCBI上公开的一个大肠杆菌E. coli的Illumina HiSeq 4000测序数据和用其组装的基因组，accession number分别为SRR8203406和GCA_002507455.1。因为基于参考基因组比对的方法，基因组重复序列会影响比对的准确率，使用像E. coli这种比较简单的基因组有利于提高分析的可靠性。另外这个基因组组装的连续性也还过得去，41条contigs。

2. 序列比对、标记duplicates

Reads比对和标记duplicates分别使用bwa和picard进行，为减少比对对结果的影响，只保留properly paired reads：

# mapping
fq1=SRR8203406_1.fastq.gz
fq2=SRR8203406_2.fastq.gz
ref=GCA_002507455.1_ASM250745v1_genomic.fna

bwa index ${ref}
bwa mem -t 8 ${ref} ${fq1} ${fq2} > out.sam
samtools view -@ 8 -bS out.sam -o out.bam

# selection of properly paired reads
samtools flagstat -@ 8 out.bam # properly paired: 98.96%
samtools view -@ 8 out.bam -h -f 83 > out.filter.sam
samtools view -@ 8 out.bam -f 163 >> out.filter.sam
samtools view -@ 8 out.bam -f 99 >> out.filter.sam
samtools view -@ 8 out.bam -f 147 >> out.filter.sam
samtools view -bS -@ 8 out.filter.sam -o out.filter.bam
samtools flagstat -@ 8 out.filter.bam # properly paired: 100%

# filtering FASTQ files
python fastq_filter.py \ 
    out.filter.sam \
    ${fq1} ${fq2} \
    fq1.filter.fastq.gz \
    fq2.filter.fastq.gz
rm *.sam

# mark duplicates
samtools sort -@ 8 out.filter.bam -o out.sort.bam
java -jar ~/software/picard/build/libs/picard.jar MarkDuplicates \
    I=out.sort.bam \
    O=out.markdup.bam \
    M=markdup.metrics

这里只把FLAG为1187、1107、1171、1123的作为duplication（0x400），而2227、2195、2211、2163、2147、2131为嵌合序列的supplementary比对或者比对错误。

3. 真阳性vs假阳性统计

首先统计各指标的值。

这里我们把通过picard MarkDuplicates得到的重复序列作为set1。把通过de novo序列比较预测的重复序列作为set2；以重复一次为例子，如果read对A和read对B经过比较相同，两者都统计进去；同理，如果read对A被标记为重复，根据picard MarkDuplicates的原理，相同5'坐标和方向的read对B也统计进去。得到set1和set2之后，以set1为标准衡量set2的结果，全集为setU：

TP = set1 & set2
FN = set1 - set2
FP = set2 - set1
TN = setU - (set1 | set2)

然后求真阳性率TPR、假阳性率FPR、精确率Precision和F1 score：

真阳性率TPR = Sensitivity = Recall = TP/(TP+FN)
假阳性率FPR = 1-Specificity = FP/(FP+TN)
精确率Precision = TP/(TP+FP)
F1 = 2*Precision*Recall/(Precision+Recall)

通过坐标从1开始，步长2；reads截取长度从6bp开始（双端共6*2=12bp），步长2进行穷举，计算上述4个指标，最终得到统计结果stat.txt：

python result_stat.py out.markdup.bam fq1.filter.fastq.gz fq2.filter.fastq.gz

4. 结果分析

(1) TPR、FPR、Precision、F1随reads截取长度的变化

• TPR：从整体上看TPR随着长度增加而逐渐减小，可能的原因是序列越长，测序错误越多，导致真阳性率下降。当使用全长序列进行分析时，TPR仅有0.41。
• FPR：除了截取长度为12bp（read1和read2各6bp）时FPR高达0.20~0.26，基本上FPR都处于很低的水平，说明只要read1和read2分别取大于等于8bp序列在本例中就能保证非常好的特异性。
• Precision：同理，除了截取长度为12bp的情况，Precision都相当高。
• F1 score：F1是平衡Precision和Recall（TPR）的综合评价指标，由于除了截取长度在12bp以外Precision都极高，因此F1的变化趋势和TPR基本保持一致。
• 较短截取长度（12、16、20bp）会导致FPR和Precision在接近3'端出现很大变化，在图中体现为离群点。

(2) TPR、FPR、Precision、F1随位点的变化

这里因为较短截取长度在接近3'端的FPR/Precision变化太大，所以去除了12、16、20bp的情况。

• 不同截取长度之间的TPR、FPR、Precision、F1随位点变化趋势非常一致。
• 由于Precision极高，F1和TPR的变化趋势基本一致。
• TPR、F1在5'端附近先增加后下降，而在3'端急速下降。这可能和5'端以及3'端较高的测序错误率有关。
• TPR、F1、Precision都大体呈现随位点下降趋势，FPR则随位点升高。可能是因为越接近3'端因为InDels导致错位的概率越大。
• FPR在5'端和3'端上升，Precision相反，但总体上变化并不大（Y轴）。

(3) 按照F1排序的Top 5

(4) 计算两家公司的方法以及几种现有软件的指标

以F1 score作为衡量标准，方法优劣排序如下：

fastp ≈ NextClip > 前公司/N公司 > A公司

这里没有比较FASTX-Toolkit和FastQC，因为这两款软件都只支持单端。

结论 & 讨论

1. 过长的截取片段的确可能因为测序错误导致重复比例被低估。按照A公司策略选取1-150全长进行分析，TPR只有0.413，按照前公司和N公司的策略选取8-113时TPR为0.71。这可以解释为什么两家公司结算结果有如此大的差异。
2. 在本例中，仅选取片段>=16bp就能得到不错的特异性。F1值最高时截取的序列范围为13-20，共(20-13+1)*2=16bp。
3. 5'端和3'端测序错误可能导致重复比例被低估（TPR下降），5'端的影响并不是特别大，但3'端附近的TPR急速下降。
4. 本例使用picard MarkDuplicates作为标准，为了防止错误比对选择了基因组重复较低的E. coli，并且只用properly paired reads构成的subset进行分析。
5. 对于复杂基因组测序结果，重复序列比例应该要高很多，因此FPR应该比本例的要高，为了保证方法的稳健性，还是应当提高截取序列的长度，仅使用16bp可能不够。而TPR应该影响不大。

代码获取

本文分析中数据下载、比对、过滤、运行picard MarkDuplicates、以及TPR、FPR、Precision、F1计算的代码可以去我的GitHub查阅：

https://github.com/zengxiaofei/PCR-duplication

参考资料

• FASTX-Toolkit: https://github.com/agordon/fastx_toolkit
• FastUniq: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0052249
• NextClip: https://academic.oup.com/bioinformatics/article/30/4/566/202704
• fastp: https://academic.oup.com/bioinformatics/article/34/17/i884/5093234
• FastQC: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/3%20Analysis%20Modules/8%20Duplicate%20Sequences.html
• Picard: https://broadinstitute.github.io/picard/command-line-overview.html#MarkDuplicates